標本製備簡單流程

關於檢體來病理科的之前與之後……

送來之前

送檢時應具備的資料包括:

  • 病患是誰,病例號。誰是誰弄錯,張冠李戴的話檢查結果再準也沒用。標示應該緊貼在裝檢體的容器上,分開的紙張容易混淆,不可接受。標示不清的檢體應立刻送回臨床醫師處,請他辨認。如果標示有問題的檢體外觀不特別,比如說 biopsy 的小碎片,那麼最好能重新採檢。
  • 誰要求這個檢查。不只是開檢查的醫師(比如開刀的外科),最好也包括 primary care 的醫師(比如送去開刀前照顧病患的內科醫師)。需要時便可以進行關於臨床病史或特殊狀況的討論。
  • 採檢日期與時間。可以提供與臨床處置的時間關係,也可以幫助判斷監控檢體運送過程是否延誤。若是一些固定時間特別重要的檢體,最好也註明放入固定液的時間。
  • 適當簡要的臨床病史。光從玻璃片是猜不出所有臨床資訊的,只看玻片就判斷的猜猜樂可能可以當作消遣或雜耍(←這是病理學聖經 Ackerman’s 寫的,不是我說的。)但實際如此行事卻非常危險。適當的臨床病史包括:
    • 標本的種類與取下的原因,比如僅供切片確認,整個取下,或者治療性的手術。(比如若在大病灶上只取一小片時,「手術邊緣沒有切除乾淨」的敘述便成多餘了。)
    • 外觀與位置。有些東西挖下來或固定之後看來便不像它在原本位置或新鮮時的模樣,有些病灶會因而看得更清楚或較不清楚。一些腫瘤在治療(放射治療或化學治療)後會縮小到肉眼難以辨識,因而也需要標明腫瘤原本的位置。送檢前,臨床醫師可先在標本上作記號,以利辨認方位。(在垂直的兩個方位縫上不同的線、畫圖、塗墨水之類。)
    • 過去病史。包括先前做過的診斷,以及病患的特殊狀況如是否有免疫低落的問題、是否有插管、是否懷孕(有些懷孕變化可能外觀像惡性變化)等。
    • 之前或最近經過的治療,包括癌症的化學或放射治療、可以改變組織外觀的用藥(例如在肝臟或子宮內膜的檢查)、可能產生特殊感染的用藥(比如免疫抑制劑)。
    • 特別想釐清的問題。可幫助決定是否進行特殊檢查、染色,或標本處理方式。
    • 趕報告。有時病人的狀況具有時間緊迫性,需要在很快知道結果來決定治療方向。像這種狀況便可註明並留下臨床醫師的聯絡方式。
  • 檢體是啥。也包括要做什麼檢查,還有是否需要特殊處理(handling),比如可能仍帶有傳染力的傳染性疾病檢體,像是 SRAS 或肺結核病患的肺與痰。
  • 運送到實驗室的時間與方法。Autolysis 是自檢體取下當時開始。
  • 若檢體最後不照一般程序丟棄,比如要歸還給病患,或者含有必須回收的器材者,請額外註明。因為按照一般程序,報告發出後檢體是要丟棄的。JCAHO 建議的保存時間是:報告與玻片十年、蠟塊至少二年、未製成蠟塊的其餘部分則是報告發出後七天。但實際狀況則因地因狀況而異。
  • 部位標示:有些東西切下來之後還能看得出是什麼位置的哪裡,上下左右如何。但有些東西則不然,只有當初將它們取下的外科醫師能清楚位置。若位置很重要,則需事先標明。

送來之後

第一優先是確認檢體。如前所述,如果一開始就張冠李戴,後面的部份就都不用玩了。如果標本有問題,應在當天所有人都記憶猶新時解決,越晚越難處理。

處理檢體要有明確目的,這目的依照檢體種類的不同與手術原因的不同而有異。如果不清楚當初開刀的原因,應在處理檢體前問個清楚。接著是確認解剖結構、位置與方向(Orientation)。有些標本可以利用解剖上的特徵來辨認方位,不過也有些在切下來後便難以分別方向。如果標本的位置對此檢體很重要,而又無法辨認,那麼應該在開始操作檢體前請採檢的臨床醫師回來認個仔細。

接下來是測量,包括各結構部分大小重量等種種。一些小檢體的塗墨水標示也可在切開之前進行。(不過在一些大檢體這樣不但不經濟,也可能遮蓋掉重要的解剖特徵。)塗過墨水的檢體一定要等墨水風乾才能切,否則刀片會把墨水帶得到處都是,也就失去標示的意義了。

Dissection and Take block

沒有好好切開看看裡面的話,就算不上是好好檢查過。第一個動作是把空心器官打開。(除非此器官是在完整的狀況下才好固定,比如膀胱,或者因憩室問題而切除的腸子。)如果有病灶,紀錄其位置、長相、並量取大小。所有病灶都有其特殊外觀,如果找不到該有的病灶,或者病灶看起來與預期不同,因而造成疑慮的話,在繼續切下去之前,應該先找老師來看。如果外科醫生表示切除了什麼特定事物,但送來的標本中卻找不到的話,必須留下紀錄。

把大大的檢體切成小塊,選取或全部,裝進大約 2.5 公分長寬,0.5 公分厚的小方塊裡。這個動作決定到最後玻片中會看見的切面與病灶部分,是很重要的動作。比如在大腸癌,選取腫瘤與正常上皮交界變化的部分,以及腫瘤侵犯最深,穿破肌肉層的相關關係,或者手術邊緣是否切除乾淨,都要靠此時的選取來表現。

淋巴結雖不起眼,找起來又煩,但卻在判斷腫瘤的預後上十分重要。小心地摸,或者把肥油浸泡在 Bouin’s 溶液(外國人用比較多,此溶液似乎因貴而在台灣較少用。我只聽學長說過但卻無緣得見。)中可助於找小的淋巴結。即使原本作的是良性疾病,若發現異常變大的淋巴結仍因留意:或許裡面躲著出人意料的東西。

固定

首先是固定。這步驟是為了使組織保持其原來的結構,不要分解/爛掉。如果爛掉了,最後顯微鏡下所能看到的也就不過是一團糊糊。以最常用的福馬林(formalin,37 % 的甲醛水溶液,一般使用 10 % 福馬林,因此是約 4% 的甲醛水溶液)來說,它與蛋白質上之氨基作用,使其產生一些 cross linkage(通常會再 lysine 殘基間連結),使其架構固定。泡過福馬林固定好的肉會有點類似煮過一樣,比較硬且有些縮水。由於福馬林進入組織的方法是通過擴散,標本的厚度與外在福馬林的多寡均會產生影響。一大團標本,卻只在周圍灑上一點點,那麼這些福馬林的濃度很快就會不夠。(想想醃小黃瓜的時候,醋可以只用抹的嗎?)組織會爛掉、病理科會抓狂,而臨床科則得不到好答案。

特殊固定:

  • 骨髓切片:Zenker’s 固定液。
  • Cytogenetic study 與 flow cytometric analysis:不要固定,需要活細胞或冷凍組織。
  • 痛風:無水酒精,因尿酸結晶溶於水。(福馬林為水溶液。)
  • 電子顯微鏡:醛類(glutaraldehyde、paraformaldehyde)、四氧化鋨 (osmium tetroxide)與高錳酸鉀(Potassium Permanganate,KMnO4)
  • 懷疑急性脂肪肝:不要固定。脂肪會在一般處理中溶掉,需要冷凍與特殊染色。

依照檢體的大小不同,固定所需的時間也不同,一般的器官通常要一個晚上,如果脂肪太多(極性低),或許要更久一些才能滲透完全。

脫水與澄清

把檢體中的福馬林與水逐步置換成酒精,是為脫水。把酒精換成 xylene,這物質可與石蠟互溶,亦可使組織變得透明,是為澄清。最後再用石蠟把 xylene 換掉,便可準備包埋切片。這步驟現在用機器做,需要一個晚上的時間。

包埋與切片

脫完水的組織塊放入融蠟中,包起做成一個個大小固定的蠟塊,就可以裝上切片機切片了。切片時最好的厚度是大約一個細胞厚,或者 5~10 μm 間。削下來的薄片很容易捲曲斷裂,因此用接近(但未到)石蠟融點的溫水將之漂浮、展平,再用玻片沾起。這部分一般是由醫檢師進行。

染色

很多種,視需要而定。一般常規的染色為 H & E,量大時用染色機自動進行。由與染色時使用的染料多為水溶性,無法進入蠟中,因此在染色前玻片上的組織必須經過 rehydrate 的過程方能染上,步驟順序與先前的脫水正好相反,一步步地換回去,這些包括在染色機的功能裡頭。

H & E 的 H 是為 hematoxylin,事實上不是真的鹼(需要媒染劑,並且不會在後續染色中脫落),不過染色結果卻類似於鹼(帶正電)會染上組織中酸性的部分,呈深藍色,是水溶性的染料;而 E 是 eosin,它是一種酸(帶負電),會染上組織中鹼性的部分,是紅色的,是溶於酒精的染料,因此在染完 hematoxylin 後要再次脫水,才染 eosin。染料的酸鹼與其顏色無關。組織中可染上鹼性染料的基團(帶正電)包括碳酸基(羧基)、磷酸基與硫酸基,三者與鹼結合的能力隨當下 pH 而改變。組織內的有些物質──比如軟骨基質、肝素顆粒,或者粗糙內質網──會對一些鹼性染料產生「異染色(metachromasia)」的效果,這是因這些位置含有超多的負電,讓吸引的染料產生雙或多聚體的聚合,而聚合之後的顏色與原本不同,比如原本是藍卻染成紅或紫。

而與鹼性染料不同,影響其與組織結合的因素不只是電荷而已,不同的酸性染料可有不同的染色效果。因此可以不同之酸性染料反覆染色,製造顏色疊加的效果,比如 Mallory staining 就用了三種酸性染料:aniline blue、acid fuchsin、orange G。不同鹼性染料偶爾亦可重複使用,但應用範圍遠不及酸性染料廣。

染完色後再經 xylene 置換,以非水性的封片膠與蓋玻片封好,才是能看的玻片。封片的動作在大量時有封片機,小量時則人工完成。而在這之後,才是真正的鏡檢。

特別染色

  • 組織化學/細胞化學(histochemistry/cytochemistry):加入特殊受質,讓組織中的酵素作用。此法乃是呈現酵素作用的結果多於染色酵素本身。
  • 免疫細胞化學(immunocytochemistry):利用帶有標記的抗體辨認組織細胞中特定的物質。分成直接與間接兩種:直接僅使用一種抗體,可辨認想染的物質,且帶有標記(螢光染料、呈色用酵素,或者重金屬);間接則使用兩種抗體,一辨認想染的物質,另一種則是帶有標記的「抗抗體抗體」,可抓住第一種抗體,如此可放大結果使敏感度增加,且可檢查更多項目。雖然有較貴而耗人工的缺點,間接技術仍已逐漸取代直接的技術。
  • Autoradiography(又稱 radioautography):用於實驗室。專門用來研究「過程」,需要用到放射性物質(通常是氚)。比如利用氚標記的胺基酸來研究蛋白質合成與包裝的過程。把標記物注入動物,按時間順序取出檢體(如五分鐘、十分鐘、十五分鐘……)。當製作玻片時,上面不蓋蓋玻片,而代以軟片(在融化的軟片中浸一下)。將製好的玻片放在暗箱中數天至數週,等待足夠顯影。然後用洗底片的方式來固定底片上的影像,蓋上蓋玻片後用顯微鏡看。由於底片的顯影事實上是銀粒沉澱,類似的技巧亦可用於電子顯微鏡。
  • 電子顯微鏡:不用可見光來穿透組織,而改用電子束來打,可用來觀看細胞中的胞器,甚至(較進步的電顯)可看到單一大分子。分成掃瞄式與穿透式兩種。
    • 穿透式電子顯微鏡:檢體的處理原則與光學顯微鏡類似,但需要更細緻的固定。常用的電顯用固定液包括醛類(glutaraldehyde、paraformaldehyde)、四氧化鋨 (osmium tetroxide)與高錳酸鉀(Potassium Permanganate,KMnO4),它們的穿透力比福馬林更差,因此浸泡時組織塊要更小(1 mm 立方)。包埋亦改成特殊塑膠,夠硬可切成 25~100 nm 的薄片,且不會吸收電子束。染色使用重金屬。
    • 掃瞄式電子顯微鏡:用來觀察檢體的表面。製備時將很薄的黃金、白金或碳覆蓋於檢體表面。用電子束掃瞄時,有些電子會被反射,有些會被彈開(ejected),這些電子被周圍的電子偵測器捕捉、計算,最後電腦再根據這些數據重新計算出物體表面的三度空間形狀,並轉換成影像。
  • Freeze -Fracture:這是用電子顯微鏡來觀察細胞膜的「裡面」的技術。將檢體急速冰凍,然後敲擊,破裂面會沿著細胞膜的雙層膜間裂開。在兩個裂面用蒸氣的方式鍍上白金或其他物質,便可使用電顯來觀察。(此時標本已溶掉,因此看到的事實上是鍍上物形成的模型。)

冰凍切片(frosen section)

用在「沒辦法在手術前確定診斷」或「手術中才發現,且需要立刻辨認已決定下步處理的病灶」,請不要用它來代替一般切片(biopsy)。好處是快(也僅只是快)。壞處卻是這種製片方式品質較差,看得比較不清楚,時間緊湊間也較易判斷錯誤。對某些較小的病灶來說,整個拿來做了冰凍切片,甚至可能影響之後的永久切片結果,慎用慎用。

首先將小片組織放進高效冰箱中 -50 度 C 急冷凍住,然後在冷凍狀態下切片、黏於載玻片。然後便可染色(通常使用快速 H&E)觀看。製備過程約十幾分鐘。

資料來源:

  • Color textbook of histology, by Leslie P. Gartner and James L. Hiatt, first edition.
  • Histology, by michael H. Ross and Wojciech Pawlina, 4th edition.
  • Manual of Surgical Pathology, by Susan C. Lester, 2nd edition.

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